Как устроен ПЦР-тест?

ПЦР — относительно недорогой метод, выполняемый большинстве молекулярных лабораторий. Он позволяет проводить быструю и высокоспецифичную амплификацию фрагментов ДНК разных размеров. Во времена пандемии COVID‑19 этот термин стал знаком практически каждому. Разбираемся, что же такое ПЦР‑тест, и как он работает.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является основой многих современных методов молекулярной биологии и молекулярной генетики. Всего за несколько часов при помощи ПЦР можно миллион раз амплифицировать (скопировать) одну молекулу ДНК. Увеличенное количество целевых молекул ДНК затем используется для анализа другими методами. Кусочки ДНК от примерно 50 пар оснований до более 10 килобаз могут быть амплифицированы даже из исчезающе малых количеств исходной геномной ДНК.

ПЦР — это реакция в одной пробирке. Каждая отдельная реакция проводится для амплификации одной конкретной геномной последовательности. Эта специфичность диктуется парой олигонуклеотидных праймеров (коротких последовательностей ДНК), предназначенных для гибридизации с фланкирующими участками целевой последовательности ДНК.

Стандартная реакционная смесь для ПЦР состоит из большого избытка пар олигонуклеотидных праймеров, матричной ДНК (обычно геномной ДНК), свободных дезоксинуклеотидтрифосфатов (оснований ДНК), реакционного буфера и термостабильной ДНК‑полимеразы (фермента, который запускает реакцию ПЦР).

Термостабильные ДНК-полимеразы оптимально функционируют при температуре около 70°C, но могут выдерживать нагревание до 95°C. Стандартный фермент, используемый в настоящее время в большинстве ПЦР, получают из бактерии Thermus (или Thermophilus) aquaticus (Taq). Частота ошибок (на нуклеотид за цикл) для стандартного Taq составляет примерно 1 из 10 нуклеотидов. Высококачественные полимеразы с возможностью проверки in vitro, полученные из архебактерии Pyrococcus furiosus (Pfu), имеют частоту ошибок примерно в 10 раз ниже, чем Taq, и используются для случаев, требующих более строгого синтеза ДНК.

Существует множество вариантов проведения ПЦР, но все они состоят из трех этапов, которые повторяются от 30 до 40 раз:
 

• Денатурация — смесь нагревают до 95°C в течение 0,5‑2 минут, что способствует денатурации двухцепочечной матричной ДНК до одноцепочечной;
• Отжиг — смесь охлаждают до температуры, которая в среднем на 5°C ниже температуры плавления используемых в реакции праймеров, что приводит к связыванию праймера с матрицами одноцепочечной ДНК с последующим связыванием ДНК-полимеразы с 3’-концом праймеров. Этот этап длится 30 секунд, и его точность значительно зависит от правильно подобранной температуры. При слишком низкой температуре высока вероятность связывания праймера в неверном месте и образования большого количества побочных продуктов. При высокой температуре праймеры, наоборот, плохо связываются с матрицей, что тоже значительно ухудшает результат;
• Элонгация — на этой стадии температура реакционной смеси вновь повышается до температуры активации полимеразы (~ 70-72°C), чтобы инициировать удлинение цепи. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь по принципу комплементарности, используя праймер в качестве затравки, начиная синтез второй цепи от 3’-конца праймера. Удлинение продолжается около одной минуты и прекращается циклическим возвратом к первой стадии реакции: нагреванию до температуры 95°C, что приводит к разделению синтезированных цепей.

Число потенциальных мишеней для отжига праймеров удваивается с каждым циклом ПЦР, а амплифицированные последовательности (ампликоны), полученные в одном цикле, служат в качестве матриц для последующих циклов реакции. Можно начать с одной молекулы матричной ДНК и создать десятки миллионов копий. Если реакция начинается с двух копий, то в результате N циклов теоретически произойдет синтез 2N копий.

После завершения реакции продукт ПЦР можно визуализировать с помощью гель-электрофореза. Гель служит молекулярным ситом, позволяя разделить фрагменты ДНК по размеру. Отрицательно заряженные фрагменты ДНК мигрируют через пористый агарозный гель к положительному электроду, причем пройденное расстояние определяется их молекулярной массой. После электрофореза и добавления флуоресцентной молекулы, которая связывается с ДНК и образует комплекс с нуклеиновыми кислотами, воздействие ультрафиолетового света на гель демонстрирует амплифицированный фрагмент в виде единой флуоресцирующей полосы.

Чтобы амплифицировать интересующую последовательность, необходимо тщательно сконструировать и синтезировать одноцепочечные олигонуклеотидные праймеры (которые обычно имеют длину 20 нуклеотидов). Высокоспецифичная амплификация может быть достигнута, если комбинация последовательностей пар праймеров присутствует в геноме только один раз. Программное обеспечение, облегчающее проектирование праймеров и рассчитывающее температуры отжига, распространяется бесплатно онлайн.

К преимуществам ПЦР, способствовавших ее повсеместному распространению, относят:
         

Из‑за чрезвычайной чувствительности метода примесь даже небольшого количества посторонней ДНК может привести к ложноположительному результату. Чтобы снизить частоту возникновения этой проблемы, диагностические лаборатории ПЦР часто делятся на отдельные зоны до и после амплификации в разных комнатах.

Для создания подходящих праймеров для ПЦР должна быть известна информация о нуклеотидной последовательности интересующей области. Идеальная длина амплифицируемой последовательности (ампликон ПЦР) составляет несколько сотен нуклеотидов. И хотя доступны методы ПЦР, позволяющие амплифицировать длинные участки ДНК, анализ очень больших областей более труден и для него обычно используют другие инструменты.

Чаще всего клиническая ценность ПЦР подчеркивается при генотипировании и секвенировании для диагностических и прогностических тестов в медицинской диагностике. Однако применений ПЦР бесчисленное множество, включая персонализированную медицину (например, оценка индивидуальной токсичности лекарств), мутагенез (внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК), клонирование генов, установление отцовства, криминалистику и многое другое.