Как устроен ПЦР-тест?

  • Терапевты
  • Пульмонологи

Как устроен ПЦР-тест?

ПЦР — относительно недорогой метод, выполняемый большинстве молекулярных лабораторий. Он позволяет проводить быструю и высокоспецифичную амплификацию фрагментов ДНК разных размеров. Во времена пандемии COVID‑19 этот термин стал знаком практически каждому. Разбираемся, что же такое ПЦР‑тест, и как он работает.

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является основой многих современных методов молекулярной биологии и молекулярной генетики. Всего за несколько часов при помощи ПЦР можно миллион раз амплифицировать (скопировать) одну молекулу ДНК. Увеличенное количество целевых молекул ДНК затем используется для анализа другими методами. Кусочки ДНК от примерно 50 пар оснований до более 10 килобаз могут быть амплифицированы даже из исчезающе малых количеств исходной геномной ДНК.

Как проводится ПЦР?

ПЦР — это реакция в одной пробирке. Каждая отдельная реакция проводится для амплификации одной конкретной геномной последовательности. Эта специфичность диктуется парой олигонуклеотидных праймеров (коротких последовательностей ДНК), предназначенных для гибридизации с фланкирующими участками целевой последовательности ДНК.

Стандартная реакционная смесь для ПЦР состоит из большого избытка пар олигонуклеотидных праймеров, матричной ДНК (обычно геномной ДНК), свободных дезоксинуклеотидтрифосфатов (оснований ДНК), реакционного буфера и термостабильной ДНК‑полимеразы (фермента, который запускает реакцию ПЦР).

Термостабильные ДНК-полимеразы оптимально функционируют при температуре около 70°C, но могут выдерживать нагревание до 95°C. Стандартный фермент, используемый в настоящее время в большинстве ПЦР, получают из бактерии Thermus (или Thermophilus) aquaticus (Taq). Частота ошибок (на нуклеотид за цикл) для стандартного Taq составляет примерно 1 из 10 нуклеотидов. Высококачественные полимеразы с возможностью проверки in vitro, полученные из архебактерии Pyrococcus furiosus (Pfu), имеют частоту ошибок примерно в 10 раз ниже, чем Taq, и используются для случаев, требующих более строгого синтеза ДНК.

Этапы ПЦР

Существует множество вариантов проведения ПЦР, но все они состоят из трех этапов, которые повторяются от 30 до 40 раз:
 
  • Денатурация — смесь нагревают до 95°C в течение 0,5‑2 минут, что способствует денатурации двухцепочечной матричной ДНК до одноцепочечной;
  • Отжиг — смесь охлаждают до температуры, которая в среднем на 5°C ниже температуры плавления используемых в реакции праймеров, что приводит к связыванию праймера с матрицами одноцепочечной ДНК с последующим связыванием ДНК-полимеразы с 3’-концом праймеров. Этот этап длится 30 секунд, и его точность значительно зависит от правильно подобранной температуры. При слишком низкой температуре высока вероятность связывания праймера в неверном месте и образования большого количества побочных продуктов. При высокой температуре праймеры, наоборот, плохо связываются с матрицей, что тоже значительно ухудшает результат;
  • Элонгация — на этой стадии температура реакционной смеси вновь повышается до температуры активации полимеразы (~ 70-72°C), чтобы инициировать удлинение цепи. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь по принципу комплементарности, используя праймер в качестве затравки, начиная синтез второй цепи от 3’-конца праймера. Удлинение продолжается около одной минуты и прекращается циклическим возвратом к первой стадии реакции: нагреванию до температуры 95°C, что приводит к разделению синтезированных цепей.

Что мы получаем в результате ПЦР?

Число потенциальных мишеней для отжига праймеров удваивается с каждым циклом ПЦР, а амплифицированные последовательности (ампликоны), полученные в одном цикле, служат в качестве матриц для последующих циклов реакции. Можно начать с одной молекулы матричной ДНК и создать десятки миллионов копий. Если реакция начинается с двух копий, то в результате N циклов теоретически произойдет синтез 2N копий.

После завершения реакции продукт ПЦР можно визуализировать с помощью гель-электрофореза. Гель служит молекулярным ситом, позволяя разделить фрагменты ДНК по размеру. Отрицательно заряженные фрагменты ДНК мигрируют через пористый агарозный гель к положительному электроду, причем пройденное расстояние определяется их молекулярной массой. После электрофореза и добавления флуоресцентной молекулы, которая связывается с ДНК и образует комплекс с нуклеиновыми кислотами, воздействие ультрафиолетового света на гель демонстрирует амплифицированный фрагмент в виде единой флуоресцирующей полосы.

Откуда берутся праймеры?

Чтобы амплифицировать интересующую последовательность, необходимо тщательно сконструировать и синтезировать одноцепочечные олигонуклеотидные праймеры (которые обычно имеют длину 20 нуклеотидов). Высокоспецифичная амплификация может быть достигнута, если комбинация последовательностей пар праймеров присутствует в геноме только один раз. Программное обеспечение, облегчающее проектирование праймеров и рассчитывающее температуры отжига, распространяется бесплатно онлайн.

Каковы преимущества ПЦР?

К преимуществам ПЦР, способствовавших ее повсеместному распространению, относят:
 
1. 
Скорость — реакция амплификации занимает около трех часов. Дополнительное время(несколько часов) требуется для того, чтобы сначала извлечь ДНК из клеток, а затем провести гель-электрофорез после завершения ПЦР. Проведение реакции в одной пробирке обеспечивает быструю обработку образцов и тестирование в месте оказания медицинской помощи.
 
2. 
Чувствительность — ПЦР позволяет амплифицировать ДНК из всего лишь одной клетки, что делает этот метод чрезвычайно чувствительным. Поэтому ее можно использовать для преимплантационной генетической диагностики эмбрионов.
 
3. 
Надежность — метод позволяет успешно и качественно амплифицировать ДНК в том числе из архивных блоков ткани.
 
4. 
Специфичность — метод позволяет обнаруживать небольшие нуклеотидные мутации, а также экспансии тринуклеотидных повторов, что важно в диагностике наследственных заболеваний.
 
5. 
Низкая стоимость и простота использования, а также возможность автоматизации, что позволяет использовать ПЦР во многих медицинских (и не только) направлениях.

Какие недостатки есть у ПЦР?

Из‑за чрезвычайной чувствительности метода примесь даже небольшого количества посторонней ДНК может привести к ложноположительному результату. Чтобы снизить частоту возникновения этой проблемы, диагностические лаборатории ПЦР часто делятся на отдельные зоны до и после амплификации в разных комнатах.

Для создания подходящих праймеров для ПЦР должна быть известна информация о нуклеотидной последовательности интересующей области. Идеальная длина амплифицируемой последовательности (ампликон ПЦР) составляет несколько сотен нуклеотидов. И хотя доступны методы ПЦР, позволяющие амплифицировать длинные участки ДНК, анализ очень больших областей более труден и для него обычно используют другие инструменты.

Где применяется ПЦР?

Чаще всего клиническая ценность ПЦР подчеркивается при генотипировании и секвенировании для диагностических и прогностических тестов в медицинской диагностике. Однако применений ПЦР бесчисленное множество, включая персонализированную медицину (например, оценка индивидуальной токсичности лекарств), мутагенез (внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК), клонирование генов, установление отцовства, криминалистику и многое другое.
 
Список использованных источников:

 
1. 
Templeton N. S. The polymerase chain reaction. History, methods, and applications //Diagnostic molecular pathology: the American journal of surgical pathology, part B. 1992; 1. (1): 58‑72;
 
2. 
Kramer M. F., Coen D. M. Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization //Current protocols in toxicology. 2000; 3 (1): 14;
 
3. 
Eckert K. A., Kunkel T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction //Genome research. 1991; 1 (1): 17‑24;
 
4. 
von Ahsen N., Wittwer C. T., Schutz E. Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas //Clinical Chemistry. 2001; 47 (11): 1956‑1961;
 
5. 
Rozen S., Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers //Bioinformatics methods and protocols. ///Humana Press, Totowa, NJ, 2000; 365‑386;
 
6. 
Kalendar R., Lee D., Schulman A. H. Java web tools for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis //Genomics. 2011; 98 (2): 137‑144;
 
7. 
Lenstra J. A. The applications of the polymerase chain reaction in the life sciences //Cellular and molecular biology. 1995; 41 (5): 603-614.
 

Вам может быть интересно

Диагностика и лечение аногенитальных бородавок в медицинской практике

Актуальное

Аногенитальные бородавки — это деликатная и неудобная тема даже при беседе с врачом, но статистика показывает, что эту проблему испытывает огромное количество людей хотя бы раз в жизни.

Читать статью

Ошибочный и пропущенный диагноз - в чем разница?

Будни врача

В чем заключается разница между пропущенным и ошибочным диагнозом? Как снизить риск подобных ошибок? Разбираемся в медицинской и юридической сторонах вопроса.

Читать статью

Что делать, если постменопаузная гормональная терапия противопоказана?

Актуальное

Для некоторых женщин проявления менопаузы становятся проблемой, заставляющей обратиться к врачу.

Читать статью

Сколько нужно спать пожилым людям

Актуальное

Согласно исследованию и короткий, и слишком продолжительный сон отрицательно влияют на когнитивные функции у пожилых людей. Сколько же нужно спать пожилым людям?

Читать статью

reSET — первое приложение для телефона, рекомендованное FDA для лечения наркомании и алкоголизма

Актуальное

reSET — программа, которая помогает избавиться от зависимости с помощью когнитивно-поведенческой терапии.

Читать статью

БА и ХОБЛ: как лечить?

Актуальное

В этом году GINA и GOLD обновили свои рекомендации по ведению пациентов с бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких.

Читать статью

Дисциплинарная и материальная ответственность работников здравоохранения: что нужно знать об этом

Актуальное

Хороший врач — это специалист, который умеет общаться с пациентами, коллегами и аккуратен в работе.

Читать статью

Алгоритм обследования и ведения необследованных пациентов с симптомами диспепсии на амбулаторном этапе

Будни врача

Простой алгоритм выбора тактики ведения первичного пациента с симптомами диспепсии в 3 этапа.

Читать статью

Ведение пациентов с артериальной гипертензией

Будни врача

Простой алгоритм выбора тактики ведения пациента с артериальной гипертензией в 3 шага.

Читать статью

Коморбидные состояния при заболеваниях печени

Актуальное

Некоторые коморбидные заболевания не очевидны, однако их нельзя исключать при ведении пациентов. Это касается и больных с различными хроническими заболеваниями печени. Основные связи и их особенности показываем на инфографике.

Читать статью

Нарушения моторики пищевода: современный подход к диагностике и терапии

Актуальное

В настоящее время достигнуты значительные успехи в понимании различных нарушений моторики пищевода. В этом тексте обсуждаем современный подход к диагностике и терапии.

Читать статью

Как предотвратить наступление деменции

Ликбез

На сегодняшний день выделяют 5 основных групп факторов риска развития деменции. Влияние на них может помочь предотвратить или отсрочить до 40% случаев деменции.

Читать статью

Комментарии: 1

Путанеска Бронеслон

27 августа 2021 00:25

Неудобно читать материал!

или

чтобы оставить комментарий.

Мы собираем и обрабатываем пользовательские данные, в том числе файлы cookies для оптимизации сайта и подбора для Вас релевантного контента. Нажав «Принять» или оставаясь на сайте, Вы разрешаете их использование. Подробнее: Политика конфиденциальности.

Принять